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Aplicações práticas da biologia molecular em hematologia

http://www.connectmed.com.br/




Dr. Auro del Giglio, professor titular de hematologia e oncologia, e chefe do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da Fundação ABC

Dr. Daniel Gianella Neto, professor livre docente da disciplina de endocrinologia da Faculdade de Medicina da USP

Dr. Israel Benedit, doutor em Medicina e médico da Fundação Pró-Sangue - Hemocentro de São Paulo



Resumo

As técnicas de biologia molecular se incorporaram ao raciocínio hematológico, ajudando a detectar mais facilmente a mutação genética das células. Este artigo descreve as técnicas apropriadas para o diagnóstico e tratamento das hematopatias.


Avaliação de alterações do DNA da célula

Alterações no DNA de uma célula podem variar desde a adição ou deleção de uma alteração de uma só base nitrogenada de um gene, de fragmentos cromossômicos ou até mesmo de cromossomos inteiros. Nessas situações, entretanto, esses dois tipos tão diferentes de alteração no DNA de uma célula podem levar à inativação completa de um gene, produzindo eventualmente o mesmo defeito genético e, conseqüentemente, um quadro clínico semelhante.

Para que possamos avaliar a existência de alterações no DNA celular, devemos conhecer técnicas simples, adequadas ao estudo de alterações mais grosseiras do número ou da morfologia cromossômica, como a citogenética, até o estudo meticuloso de alteração de bases individuais, como o seqüenciamento de um gene discutido acima. Podemos ainda, no caso de alterações envolvendo deleções ou amplificações de fragmentos de um gene, utilizarmos técnicas como a Southern Blot.

Para que possamos entender o impacto de uma mutação de uma simples base nitrogenada sobre a função de uma molécula, e na gênese de um quadro clínico peculiar, podemos tomar como exemplo a anemia falciforme.

Na anemia falciforme, ocorre a mutação de uma só base nitrogenada, ou seja, uma adenina é substituída por uma timina. Em conseqüência dessa mutação, uma valina (VAL ou V) toma o lugar do ácido glutâmico (GLU ou E) na posição 6 da cadeia protéica da globina (mutação E6V). Essa alteração promove uma modificação da molécula de hemoglobina, facilitando a polimerização intracelular, resultando na falcização das hemácias levando o aumento da destruição dessas, e fenômenos vaso-oclusivos característicos do quadro clínico da anemia falciforme.

Ao compreendermos as diferentes maneiras pelas quais é possível se detectar essa mutação, poderemos ter uma noção da utilidade prática em hematologia das técnicas de biologia molecular. Tal mutação pode ser detectada por várias técnicas, tais quais:

Mutações podem ocorrer através da adição, deleção ou pela substituição de uma base nitrogenada. Se essa mutação ocorrer em uma das seqüências exônicas e, portanto, transcritas do gene poderemos ter, então, no caso da deleção ou adição de um nucleotídeo, uma mudança completa da seqüência do quadro de leitura do gene ("read-frame shifting"). No caso de sua substituição por uma outra base nitrogenada, poderemos ter a incorporação de um aminoácido diferente à proteína codificada com alterações de sua estrutura e função em decorrência dessa mudança. A substituição de uma base nitrogenada pode acarretar ainda a parada súbita da síntese da proteína, se essa substituição levar à formação de um codon de parada da síntese protéica ("stop codon"). Portanto, de acordo com a localização e natureza de uma mutação, uma simples substituição, deleção ou adição de uma base nitrogenada pode levar a conseqüências devastadoras sobre a proteína que seria codificada pelo gene mutado.

Certas doenças, por exemplo, são produto de uma alteração mais grosseira do DNA celular, como por exemplo, a translocação entre os cromossomos 9 e 22 presente em 95% dos casos de Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Nessa enfermidade, a detecção dessa translocação pode ser efetuada pelo estudo citogenético, por Southern blot e por PCR.

As técnicas de Southern blot e PCR procuram evidenciar a presença do gene híbrido bcr-abl, produto dessa translocação, através da construção de uma sonda, ou de oligonucleotídeos que flanqueiem essa translocação. Assim, apenas indivíduos portadores dessa translocação terão a hibridização da sonda na técnica de Southern ou a amplificação do gene híbrido pela técnica de PCR. Indivíduos que não tenham essa translocação, por não terem as seqüências bcr-abl justapostas, não possuem, por conseguinte, o substrato para a hibridização ou amplificação efetiva, respectivamente, por essas técnicas.

Como a técnica de PCR é muito mais sensível que a de Southern blot, podemos utilizá-la no monitoramento do desaparecimento ou recrudescência do processo neoplásico em pacientes com LMC, pós transplante alogênico de medula óssea. Tal investigação para a presença de doença na sua forma subclínica, através de técnicas moleculares como o PCR capaz de detectar uma célula anormal entre 10 6 células normais, se denomina avaliação de doença residual mínima. Uma outra utilidade das técnicas de PCR e Southern blot é a detecção da monoclonalidade de certos tumores hematológicos como, por exemplo, os linfomas.

No processo de maturação normal de células B e T há o rearranjo dos genes de imunoglobulina e do receptor de células T, respectivamente. Se, houver uma expansão de células originadas de um clone, o rearranjo de seus genes pode ser detectado pela técnica de Southern blot ou de PCR. Esse achado nos permite concluir que estamos diante de uma população monoclonal de células, o que é compatível, na maioria das vezes, com um diagnóstico de malignidade.


Terapia gênica: o futuro

A importância dos conhecimentos derivados da biologia molecular está sendo incorporado também à terapêutica. O conhecimento cada vez maior que paulatinamente se acumula acerca da base molecular de várias hematopatias, permite a idealização de estratégias terapêuticas que, em nível molecular (terapia gênica), possam corrigir os defeitos genéticos que causam essas doenças. Conhecimentos acerca da regulação da expressão gênica e a possibilidade da transfecção de genes ex vivo para células progenitoras hematopoéticas abrem avenidas de investigação importantes para o tratamento das doenças hematológicas.

Talvez o primeiro exemplo de terapia gênica em hematologia seja a utilização de doses farmacológicas de ácido transretinóico (ATRA) para o tratamento de pacientes com leucemia promielocítica portadores da translocação entre os cromossomos 15 e 17. Nesses casos acredita-se que, devido a essa translocação que envolve o receptor para retinóides endógenos, haja uma insensibilidade dos precursores mielóides a essas substâncias que, em concentrações fisiológicas, teriam um papel na diferenciação desses precursores em células mielóides maduras. Como resultado do tratamento com doses fisiológicas de ATRA, contornar-se-ia, então, essa insensibilidade com a progressão da diferenciação normal dessas células para células mais maduras. De fato, quando se tratam pacientes com este tipo de leucemia, observa-se que há uma maturação dos promielócitos anormais e se atinge um estado de remissão hematológica sem a aplasia medular peculiar à utilização de quimioterapia antineoplásica.

Um outro exemplo de estudo de terapia gênica na área hematológica está em andamento no MD Anderson Cancer Center, em Houston, onde se investiga a transfecção de um gene (MDR) que confere a resistência a múltiplas drogas em células progenitoras hematopoeticas em pacientes com câncer de mama metastático. Tal medida poderá facilitar em muito a aplicação de quimioterapia antineoplásica mielossupressiva por permitir um menor efeito inibitório da quimioterapia sobre a hematopoese.

Claramente, as técnicas de biologia molecular se incorporaram ao raciocínio hematológico e, por conseguinte, devem ser conhecidas conceitualmente por todos aqueles que queiram se dedicar ao tratamento das hematopatias.


Referências bibliográficas

  1. Yee D., Von Hoff DD. Molecular biology for the oncologist. In Calabresi P., Schein PS. (eds), Medical Oncology, second edition, McGraw-Hill, New York, 1993:3-22.

  2. Kaushansky K. Glossary of molecular biology terminology. In Kaushansky K., McArthur JR. (eds). Hematology 1995: educational program american society of hematology. American Society of Hematology, 1995:125-141.

  3. Mendelsohn J., Howley PM., Israel MA., Liotta LA (eds). The molecular basis of cancer. WB Saunders Co, Philadelphia, 1995.

 

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